Research Plan
Plan badawczy
Lactobacillus sp.
Fermentation of sour cherry juice using plant origin lactic acid bacteria
Bioavailability of polyphenols after oral administration is conditioned by the hydrolysis of the glycoside linkage in the small intestine. On the other hand, lactic fermentation of sour cherry juice is crucial to the detailed characteristic of flavonols composition. Thus the selection of bacteria strains (among plant-associated Lactobacillus sp.) exhibiting the highest β-glucosidase activity can improve the fermentation process. The process conditions, the amount of added juice and a supplementation with yeast extract will be optimised.
Fermentacja soku z wiśni przy użyciu bakterii kwasu mlekowego pochodzenia roślinnego
Biodostępność polifenoli po podaniu doustnym zależy od hydrolizy wiązania glikozydowego w jelicie cienkim. Z drugiej strony fermentacja mlekowa soku z wiśni ma kluczowe znaczenie dla szczegółowej charakterystyki składu flawonoli. W związku z tym wybór szczepów bakterii (spośród Lactobacillus sp. związanych z roślinami) wykazujących najwyższą aktywność β-glukozydazy może poprawić proces fermentacji. Warunki procesu, ilość dodanego soku i suplementacja ekstraktem drożdżowym zostaną zoptymalizowane.
Danio rerio
Analysis of the biological activities of sour cherry flavonols in an animal model – zebrafish larvae
An in vivo experiment using zebrafish larvae is planned to evaluate the toxicity of the most abundant sour cherry flavonols in the FET test followed by their effects on the locomotor activity and anxiety behaviour of the larvae. FET test allows to determine a range of effective concentrations and/or the lethal dose expressed by the LC50 index. The potential neuroprotective and neuronal repair effects of the flavonols will be tested in a model of 6-OHDA-induced neurodegeneration.
Analysis of biological effects of sour cherry flavonols in 3-month-old zebrafish – behavioural studies
3-month-old adult zebrafish will be treated with flavonols. The stock solutions of flavonols will be prepared in DMSO and diluted into water of each tank. After 30-day exposure, all fish will be subjected to behavioural tests followed by anaesthesia and dissected on ice to isolate brains.
Analiza aktywności biologicznej flawonoli z wiśni w modelu zwierzęcym – larwach Danio pręgowanego
Planowane jest przeprowadzenie eksperymentu in vivo z wykorzystaniem larw Danio w celu oceny toksyczności flawonoli wiśniowych w teście FET, a następnie ich wpływu na aktywność lokomotoryczną i zachowania lękowe larw. Test FET pozwala określić zakres skutecznych stężeń i/lub dawkę śmiertelną wyrażoną wskaźnikiem LC50. Potencjalne działanie neuroprotekcyjne i naprawcze neuronów flawonoli zostanie zbadane w modelu neurodegeneracji wywołanej 6-OHDA.
Analiza biologicznego działania flawonoli z wiśni w 3-miesięcznych rybach Danio pręgowanych – badania behawioralne
3-miesięczne dorosłe ryby będą poddane działaniu flawonoli. Roztwory podstawowe flawonoli zostaną przygotowane w DMSO i rozcieńczone w wodzie każdego zbiornika. Po 30-dniowej ekspozycji wszystkie ryby zostaną poddane testom behawioralnym, a następnie znieczulone i zostaną wyizolowane na lodzie ich mózgi
LC-MS/MS
Qualitative and quantitative evaluation of flavonol aglycones in fermented sour cherry juice using HPLC-MS
The polyphenolic compounds will be extracted from the fermented sour cherry juice and characterised by HPLC coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometer (6550 iFunnel Q-TOF, Agilent Technologies) based on flavonols analytical standards. The assignment of flavonols to the measured signal will be carried out by comparing the experimental spectra with MS/MS spectra available in the Metlin database and the MS/MS spectra obtained experimentally for their analytical standards. Identified flavonols will be reanalyzed using HPLC coupled to triple quadrupole mass spectrometer (TQ, Agilent Technologies) operated in dMRM mode (including the LOD and LOQ determination). The aim is to compare the content of individual flavonols in the extracts obtained by using different lactic bacterial strains.
Qualitative and/or quantitative evaluation of flavonols in zebrafish brain using HPLC-MS
The brain homogenat for the HPLC-MS analysis will be prepared with the highest effort to recover even trace amounts of tested flavonols. The HPLC-MS analysis will be performed to find flavonols in the brains. Then HPLC-TQ will be used for the quantitative analysis of flavonols found in the brains using isotopically labelled standards.
Jakościowa i ilościowa ocena aglikonów flawonoli w sfermentowanym soku z wiśni przy użyciu HPLC-MS
Związki polifenolowe zostaną wyekstrahowane ze sfermentowanego soku z wiśni i scharakteryzowane za pomocą HPLC sprzężonego z kwadrupolowym spektrometrem masowym typu time-of-flight (6550 iFunnel Q-TOF, Agilent Technologies) w oparciu o standardy analityczne flawonoli. Identyfikacja flawonoli zostanie przeprowadzone poprzez porównanie widm eksperymentalnych z widmami MS/MS dostępnymi w bazie danych Metlin oraz widmami MS/MS uzyskanymi eksperymentalnie dla ich standardów analitycznych. Zidentyfikowane flawonole zostaną ponownie przeanalizowane przy użyciu HPLC sprzężonego z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym (TQ, Agilent Technologies) działającym w trybie dMRM (w tym określenie LOD i LOQ). Celem jest porównanie zawartości poszczególnych flawonoli w ekstraktach uzyskanych przy użyciu różnych szczepów bakterii mlekowych.
Jakościowa i/lub ilościowa ocena flawonoli w mózgu danio pręgowanego przy użyciu HPLC-MS
Homogenat mózgu do analizy HPLC-MS zostanie przygotowany z najwyższą starannością, aby odzyskać nawet śladowe ilości badanych flawonoli. Analiza HPLC-MS zostanie przeprowadzona w celu wykrycia flawonoli w mózgach. Następnie HPLC-TQ zostanie wykorzystane do analizy ilościowej flawonoli znalezionych w mózgach przy użyciu standardów znakowanych izotopowo.
In vitro analysis of biological activities of sour cherry flavonols
The evaluation of in vitro biological activities such as the antioxidant, anti-ChE and anti-COX-2 activities as well as the inhibition of the amyloid β (1-42) aggregation is an important element of the project to find flavonols exhibiting effects crucial for the potential treatment of neurodegenerative disorders. Thus antioxidant effects of flavonols will be examined using a wide range of methods (the ABTS, DPPH, CUPRAC, FRAP, HORAC, ORAC assays and/or lipid peroxidation inhibition assay with linoleic acid). Anti-ChE activities will be tested against both cholinoesterases. Their ability to inhibit COX-2, which predominates in the inflammation process, will be also examined. The inhibition of the amyloid β (1-42) aggregation will be tested in the thioflavin T assay.
Analysis of inflammatory markers, antioxidant enzyme activities and selected genes expression in zebrafish brain
The possible action of flavonols in the brain will be analysed to test the mechanisms, in which flavonols may reduce the risk associated with oxidative stress and inflammation in the brain observed in neurodegenerative diseases. Thus the adult zebrafish brain homogenat will be used to determine the activity of antioxidant enzymes (SOD, CAT, GR and GPx), COX-2 and the inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) using high sensitive assay kits. The expression of the inflammatory genes (iNOS, NF-ҡB, TNF-α) will be also studied by the RT-PCR of total RNA extracted from the brain tissue.
Analiza aktywności biologicznej flawonoli z wiśni w warunkach in vitro
Ocena aktywności biologicznej w warunkach in vitro, takiej jak aktywność przeciwutleniająca, anty-ChE i anty-COX-2, a także hamowanie agregacji amyloidu β (1-42), stanowi ważny element projektu mającego na celu znalezienie flawonoli wykazujących działanie kluczowe dla potencjalnego leczenia zaburzeń neurodegeneracyjnych. Dlatego też działanie przeciwutleniające flawonoli zostanie zbadane przy użyciu szerokiej gamy metod (testy ABTS, DPPH, CUPRAC, FRAP, HORAC, ORAC i/lub test hamowania peroksydacji lipidów z kwasem linolowym). Działanie anty-ChE zostanie zbadane w odniesieniu do obu cholinesteraz. Zbadana zostanie również ich zdolność do hamowania COX-2, który dominuje w procesie zapalnym. Hamowanie agregacji amyloidu β (1-42) zostanie zbadane w teście tioflawiny T.
Analiza markerów stanu zapalnego, aktywności enzymów antyoksydacyjnych i ekspresji wybranych genów w mózgu danio pręgowanego
Przeanalizujemy możliwe działanie flawonoli w mózgu, żeby sprawdzić czy mogą one zmniejszać ryzyko związane ze stresem oksydacyjnym i stanem zapalnym w mózgu, które obserwujemy w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym celu wykorzystany zostanie homogenat mózgu dorosłej danio pręgowanej w celu określenia aktywności enzymów antyoksydacyjnych (SOD, CAT, GR i GPx), COX-2 i cytokin zapalnych (IL-1β, IL-6, TNF-α) przy użyciu wysoce czułych zestawów testowych. Ekspresja genów zapalnych (iNOS, NF-ҡB, TNF-α) zostanie również zbadana za pomocą RT-PCR całkowitego RNA wyekstrahowanego z tkanki mózgowej.